O immunoblot consiste em um ensaio imunoenzimático que também é conhecido como western blotting. Considero o termo western bloting incorreto, já que o mesmo refere-se somente ao procedimento da eletrotransferência para membrana de nitrocelulose.
O teste é utilizado como um valioso recurso na caracterização de frações antigênicas imunodominantes e identificação da reatividade específica de anticorpos detectados por um teste de triagem utilizando múltiplas frações antigênicas (teste confirmatório ou suplementar). Para a detecção da interação antígeno-anticorpo é necessário em primeiro lugar a obtenção da membrana com as frações da misturantigênica, onde as proteínas são separadas de acordo com o seu tamanho, através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Depois de separadas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose onde ficam inertes e posteriormente serão utilizadas como suporte para a detecção da interação antígeno-anticorpo.
Eletroforese
A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) utiliza o detergente aniônico dodecil-sulfato de sódio (SDS), que confere carga negativa às proteínas, facilitando a separação por peso molecular. Laemmli foi o idealizador da técnica em 1970 quando a utilizou com a finalidade de determinar a mobilidade das proteínas em gel submetido à corrente elétrica. A mobilidade esta relacionada diretamente ao tamanho da proteína.
Outro fator que influencia na mobilidade ante ao gel, é o tamanho dos poros do mesmo. Para melhor resolução de peptídeos de pesos moleculares abrangendo uma faixa maior, é comum a utilização de gradiente do gel, de 5% a 20%, por exemplo. Desse forma, as proteínas grande ficaram retidas no início da corrida e os pequenos peptídeos irão migrar até o final do gel na eletroforese.
A amostra de proteínas que será aplicada no gel é tratada para estar solubilizada e também é desnaturada com a quebra das pontes dissulfeto, forças eletrostáticas e pontes de hidrogênio. Na solução de tratamento da amostra podem ser utilizados agentes dissociantes (Uréia, EDTA), redutores (2-mercaptoetanol, ditiotreirol) e detergentes aniônicos (SDS, desoxicolato de sódio) e, em algumas situações, detergentes não-aniônicos são utilizados (Tween 20, Triton X-100). A amostra também é aquecida em banho até fervura por 5 minutos, geralmente, para garantir a melhor discriminação dos componentes da mistura.
Na solução de amostra também é adicionado glicerina, que irá facilitar a penetração da amostra no gel, e como marcador de corrida é utilizado o corante azul de bromofenol. A coloração do gel tem por finalidade a identificação da composição de proteínas e peptídeos. A coloração realizada pelo Coomassie blue detecta facilmente concentrações da ordem de 10 ng e a realizada por nitrato de prata é mais sensível, detecta até 0,1 ng, sendo irreversíveis as duas colorações citadas.
Conforme o princípio da eletroforese, as frações anitgênicas sofrem ação de carga elétrica, migrando para o pólo positivo. Conforme já sabido, as proteínas de menor tamanho migram com maior velocidade que as proteínas de tamanho maior, pela barreira física estabelecida pelo sistema do gel.
Uma vez separadas pelo tamanho, a posição das proteínas é definida por comparação à migração de um padrão de moléculas de tamanho molecular conhecido. Dessa forma, é possível determinar com precisão o tamanho molecular de proteínas entre 5 e 250 KDa.
Eletrotransferência
Após a separação das proteínas, elas são então eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose pelo fato do gel de eletroforese ser um meio pouco apropriado para a imunodetecção, por não ser um bom suporte para as ligações antígeno/anticorpo. A membrana de nitrocelulose possui grupos nitro ligados à celulose produzindo desta forma um suporte com alta afinidade por proteínas, fazendo com que estas permaneçam presas a sua superfície. Para transferir o antígeno do gel de eletroforese para a membrana utiliza-se um campo elétrico (mesmo princípio da eletroforese). Ao final da eletrotransferência essa membrana servirá como suporte para o ensaio imunoenzimático (Immunoblot).
Neste método, é feito um “sanduíche” com a membrana. Conforme ilustrado na figura abaixo, o sanduíche é montado sobre o ânodo (+) onde é colocada uma esponja, um papel filtro, a membrana de nitrocelulose e em seguida o gel, depois outro papel filtro e outra esponja que entrará em contato com o cátodo (-). O “sanduíche” deve ser montado conforme ilustrado para que as proteínas presentes no gel, ainda embebidas em SDS (-), possam migrar para o ânodo (+), conforme o princípio da eletroforese.
No final da elterotransferência a membrana é corada com Ponceaus S, um corante removível após lavagens, para evidenciar a eficiência da transferência.
Vídeo 1:
Vídeo 2:
IMMUNOBLOT (protocolo)
Bloqueio
A membrana possui uma alta afinidade por proteínas, dessa forma, é necessário bloqueá-la para evitar que os anticorpos se liguem a toda a superfície da membrana e não, como desejado, especificamente ao antígeno. Para bloquear a membrana geralmente é utilizado leite em pó desnatado (LD), mas polímeros sintéticos como a poli-vinil-pilorridona (PVP) também podem ser usados, especialmente em casos onde os componentes do leite prejudicam a ligação antígeno/anticorpo.
O bloqueio é realizado com a solução de bloqueio (tampão TBS pH 7,5 + Tween 20 0,3% + Leite Desnatado 5%) por 1 hora incubado em temperatura ambiente em constante agitação.
Primeiro anticorpo
Após o bloqueio, a membrana é lavada com a solução de lavagem (TBS + Tween 20 0,3%) por 3x a cada 5 minutos.
Depois de lavada, é adicionada a membrana o primeiro anticorpo (amostra – SORO), ou seja, aquele que se ligará ao antígeno presente na membrana. A diluição do anticorpo é realizada na solução de bloqueio (tampão TBS pH 7,5 + Tween 20 0,3% + Leite Desnatado 5%). A diluição de 1/100 é a padronizada em alguns protocolos para a utilização do soro de pacientes. Após a aplicação na membrana, a mesma deve ser incubada em temperatura ambiente por 1 hora em constante agitação. Quando o tempo de reação não é especificado pelo fabricante (no caso de anticorpos comerciais) precisam ser determinados empiricamente.
Segundo anticorpo
O segundo anticorpo (conjugado) pode ser definido como moléculas de antígenos ou anticorpos ligados covalentemente à enzima, de modo a conservar as duas funções das duas moléculas conjugadas: atividade enzimática da enzima e antigenicidade do antígeno ou especificidade da imunoglobulina. Ou seja, a definição para conjugado é: duas moléculas covalentemente ligadas e que preservam suas funções originais. O segundo anticorpo é desenvolvido contra o IgG do animal no qual foi desenvolvido o primeiro anticorpo. No caso se tratando de amostra clínica, algum animal (por exemplo: camundongo) é sensibilizado com o primeiro anticorpo e dessa forma é produzido anticorpos contra o mesmo, uma anti-IgG. Depois uma enzima é conjugada a esse IgG e assim é utilizado para o procedimento. Por exemplo: se o primeiro anticorpo foi desenvolvido em camundongo, precisaremos neste passo um anticorpo anti-IgG de camundongo (obviamente desenvolvido em outro animal). O processo descrito anteriormente não será abordado nesse post.
A enzima utilizada no protocolo aqui descrito é a fosfatase alcalina, sendo o substrato para obtenção de produto insolúvel é utilizado 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) e nitroblue tetrazólio (NBT), no tópico seguinte descreverei a função do substrato na reação.
O segundo anticorpo deve ficar incubado em temperatura ambiente em constante agitação por 1 hora.
Substrato
O substrato cromogênico sob ação enzimática origina produtos coloridos, que pode ser solúvel ou insolúvel, cuja quantificação é feita pela medida da densidade óptica da solução em espectrofotômetro, ou pela intensidade de cor visual, ou comparada a algum padrão de referência, padrão de peso molecular (PPM).
Diagnóstico Laboratorial 